Amplisense hcv fl

Simptomi

Na toplinske ljeta u jezerima, parkovima i trgovima, aktivnim glinama. Tom, perebuivaychi na naturí, varto pourbuvatisya o vlasnu bezpeku, abi.

2017/03/01

test AmniSure

Kupi test za određivanje propuštanja amnionske tekućine u trudnoj Amnishuru možete također u ljekarnama u Kijevu:
1. Ljekarne "Arnika".

2016/08/26

FLOROTSENOZ

Kompleksno ispitivanje nove generacije za dijagnozu svih klinički značajnih infekcija urogenitalnog trakta kod žena reproduktivne dobi.,

Upute. "AmpliSens HCV genotip-FL" AmpliSens

prijepis

1 UPUTA za korištenje reagensa kit za detekciju i razlikovanje genotipova hepatitisa C (HCV) u kliničkim uzorcima lančanom reakcijom polimeraze (PCR), uz detekciju hibridizacije-fluorescencije u „realnom vremenu” modu „AmpliSens HCV genotip-FL» AmpliSens državni proračun institucija znanost „središnji istraživački institut epidemiologije”, Ruska Federacija, Moskva, ulica Novogireevskaya 3a kuća

2. SADRŽAJ Popis kratica. 3 svrhu. 3. načelo metode. 3 formatu i reagensa PROIZVODNJA kit. 5. ANALITIČKI HARAKTISTIKI. 5 MJERE. 6 dodatnih materijala i opreme. 7. Uzmite, transport i skladištenje ispitivanog materijala. 9. Sastav ASPEKT FRT PCR-RNA ekstrakciju iz ispitivanja uzorka RASPORED reakcija reverzne transkripcije A. Priprema cijevi za reverzne transkripcije B. izvođenje reakcije reverzne transkripcije amplifikacije sa detekcijom na „realnom vremenu”, A. Priprema cijevi A1 za pojačanje. Priprema epruvetama za amplifikaciju koristeći set „PCR” reagensi varijanti FRT-G A2. Priprema epruvetama za pojačavanje pomoću reagensa iz pribora „PCR” varijanta FRT-G B koji obavljaju prepoznavanje pojačanja u „realnom vremenu”, analize i tumačenje rezultata, rok trajanja transporta i skladištenja Dodatak 1. Ekstrakcija RNK uporabom kita reagenasa " ribo-oskoruša "Dodatak 2. RNA ekstrakcija s kit reagensa" ribo-prep „simboli korišteni u tiskanom x produkt (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / str. 2 32

3 Sljedeće kratice i simboli koji se koriste u ovim uputama: DNA dezoksirubonukleinovaya kiselina cDNA komplementarne DNA RNA ribonukleinske kiseline s reverznom transkripcijom EKO kontrolna uzorka unutarnje OKO negativna kontrola PKO pozitivna kontrola K + - pozitivna kontrola PCR K - negativna kontrola PCR redu - negativni PCR vađenje kontrola polimeraze lančana reakcija FBUN Središnjeg Research Institute of Epidemiology HCV FRT SVRHU federalnom proračunu utvrđeno ix znanost „središnji istraživački institut za epidemiologiju” od Savezne službe za nadzor zaštite potrošača prava i dobrobiti čovječanstva u hepatitis C virus otkrivanje fluorescencije u „realnom vremenu” Reagensi „AmpliSens HCV-genotip-FL” je namijenjen za otkrivanje i diferenciranja genotipova virusa hepatitisa C (HCV) u kliničkim uzorcima lančanom reakcijom polimeraze (PCR), hibridizacije s detekcijom fluorescencije-u „realnom vremenu”. Određivanje genotipovi HCV-1a, 1b, 2, 3a, 4 vrši se pomoću "PCR kit" varijanti FRT-g1-4; određivanje genotipa HCV 1A, 1B, 2, 3a, 4, 5a, 6 vrši se preko "PCR" varijanti FRT-g1-6. Taj kit reagensa preporuča se koristiti nakon detekciju HCV RNA u uzorcima pomoću pribora dizajniran za kvalitativno i kvantitativno određivanje HCV RNA (na primjer, „AmpliSens HCV-FL», koristeći detekciju gibridizatsionnofluorestsentnuyu ili „AmpliSens HCV erh „pomoću elektroforetski otkrivanje proizvoda amplifikacije (proizveden FBUN Epidemiology CRI)). UPOZORENJE! PCR rezultati analize iskazuju se u složenom dijagnoza bolesti 1. Princip postupka 1. U skladu s EU Direktivom 98/79 / EZ. 2 (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER /, str. 3 32

4 temelji se na načelu ispitivanje RNA ekstrakciju iz krvne plazme, zajedno s rekombinantnim unutarnje kontrole uzorka (ASD), izvođenje RNA reakcije reverzne transkripcije i PCR amplifikacije cDNA detekcije gibridizatsionnofluorestsentnoy u „realnom vremenu”. Da bi se isključio lažno negativnih rezultata u istraživanju ušao EKR, koji vam omogućuje kontrolu svih faza analize i ocjene utjecaja inhibitora PCR o rezultatima istraživanja. Određivanje genotipa HCV jednog uzorka se drži u više cijevi, svaka cijev u dva diferenciranih HCV genotip, ili jedan genotipa i HCV EKO. Komplet je namijenjen uređajima s dva ili više kanala detekcije fluorescencije. U tablici su navedeni kanali kroz koje se genotipovi HCV detektiraju za svaku reakcijsku smjesu. Reakcijska smjesa 1b / 3a 1a / 2/4 EKR 5a / 6 genotipova 2 kanala detektabilne količine HCV FAM / zelena 1b 1a ASD 5a JOE / HEX / žuta / Cy3 3a je dio "PCR" varijanti FRT-g1-6. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 4 od 32

5 format i ispušnih KIT reagenasa seta proizveden u jednom formatu: Format FRT seta proizveden u 7 oblika postavljena: Oblik 1 sadrži reagens pribora „ribo-oskoruša” varijanta 50 „Reverte-L» opcija 50 ‘PCR’ opcija FRT-g1-4. Oblik 2 uključuje setove reagensa "ribo-prep" varijanta 50 „Reverte-L» opcija 50 "PCR" varijanta FRT-g1-4. Obrazac 3 uključuje skup opcija "PCR kit" reagensa FRT-g1-4. Oblik 4 uključuje kit reagensa za "ribo-sorbira" varijanti 50 „Reverte-L» opcija 50 "PCR" varijanta FRT-g1-6. Oblik 5 uključuje reagense za reagensa "RIBO-prep" verzija 50, opciju "REVERTA-L" 50, opciju "PCR kit" FRT-g1-6. Oblik 6 sadrži skup reagensa "PCR kit" opcija FRT-g1-6. Oblik 7 uključuje rasute reagencije u rasutom stanju, pakiran u zasebne reagense, obilježen s reagensima na veleprodajnoj ambalaži. Oblik konfiguraciju 1, 2, 3 su dizajnirani kako bi se utvrdilo genotipovima 1a, 1b, 2, 3a, 4 C. Oblici HBV sklopa 4, 5, 6 su dizajnirani kako bi se utvrdilo genotipova 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6 HCV C. tvori sklop 1, 2, 4, 5 su dizajnirani za obavljanje cjelovitu PTsRissledovaniya uključujući ekstrakciju RNA iz kliničkog materijala, provođenje reverznu transkripciju RNA i cDNA PCR amplifikacije detekcije gibridizatsionnofluorestsentnoy u „realnom vremenu”. Oblici opreme 3 i 6 su dizajnirani za PCR amplifikaciju kdnk s hibridizacijskim fluorescentnim detekcijom u "realnom vremenu" modu. Provesti potpunu analizu je potrebno koristiti reagens setove FBUN Proizvodnja Research Institute Epidemiološki za RNA ekstrakciju (reagent kompleti "ribo-sorbira" ili "ribo-prep"), a reakcija reverzne transkripcije (kit reagens „Reverte-L»). Oblik konfiguracije 7 je namijenjen proizvodnji radi naknadnog označavanja na jeziku kupca i postavljanja u setove. UPOZORENJE! Korištenje 7 oblika kompletan set samo u skladu s pravilima odobrenim FBUN središnji istraživački institut Epidemiology. ANALITIČKE ZNAČAJKE 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 5 od 32

6. Analitički ekstrakciju Volumen osjetljivost, l komplet za vađenje RNA / DNA 100 "ribo-oskoruša" 100 "ribo-prep" kit za pojačanja i detekcije "PCR" varijanta FRT-g1-4 «PCR” Izvedba FRT- g1-6 «PCR” varijanta FRT-g1-4 «PCR” varijanta FRT-g1-6 analitičkom osjetljivošću, IU / ml 5x10 3 2,5x10 3 analitički specifičnost Procjena analitički kit reagensa specifičnost ne pokazuju unakrsnu reakciju između genotipovi 1A, 1B, 2, 3a, 4, 5a i 6 hepatitis C virusa pomoću visoko rekombinacije kovarijacijske pozitivni kontrolni uzorci plazme i uzorci krvi odgovara genotipova HCV. MJERE rad se mora provesti u laboratoriju obavljaju molekulyarnobiologicheskie (PCR) proučava kliničkih uzoraka na prisutnost zaraznih agensa, u skladu sa sanitarno-epidemiološke pravila SP „sigurnosti rada s bakterijama III IV patogenosti skupine (opasnosti) i aktivatora parazitskih bolesti”, SanPin „Sanitarna epidemiološke zahtjevi za upravljanje medicinskim otpadom „i smjernicama MU” organizacije laboratorija koji koriste metode pojačanje n kleinovyh kiseline pri radu s materijal sadrži mikroorganizama patogenosti skupine I. IV”. U pogonu je uvijek ispunjavati sljedeće uvjete: - To bi se trebalo smatrati test uzoraka zarazne i opasne poslove organiziranja i skladištenje u skladu sa SP „sigurnosti rada s bakterijama III IV patogenosti skupine (opasnosti) i parazitskih uzročnika bolesti.” - Za čišćenje i dezinfekciju boci uzoraka ili reagense pomoću sredstva za dezinfekciju u skladu sa SP „sigurnosti rada s mikroorganizmima III IV patogenosti skupine (opasnosti), te sredstva protiv parazita bolesti”. - Laboratorij proces bi trebao biti jednosmjeran. Analiza je provedena u 2 (RG, iQ, MX, dt, SC) / VER / str. 6 32

7 zasebnih soba (zona). Rad treba početi u zoni Spin-zoni i dalje pojačanje i otkrivanje. Ne vraćajte uzoraka, opreme i materijala u zoni u kojoj je proces izvodi prethodni korak. - Uklonite nekorištene reagensa u skladu s SanPiN „sanitarnih uvjeta za upravljanje medicinskim otpadom”. UPOZORENJE! Prilikom uklanjanja otpada nakon amplifikacije (epruvete koje sadrže PCR proizvoda) neprihvatljivim otvora cijevi i prskanje sadržaja, kao što to može dovesti do kontaminacije proizvoda PCR laboratorijske opreme i prostora, reagensa. Koristite set strogo prema namjeni, u skladu s ovim uputama. Dopustite samo ovlaštenom osoblju da radi s priborom. Nemojte koristiti komplet nakon datuma isteka. Koristite Rukavice za jednokratnu uporabu, laboratorijske ogrtače, zaštitu za oči dok je radio s uzorcima i reagensa. Oprati ruke temeljito nakon završetka rada. Izbjegavati dodir s kožom, očima i sluznicama. U slučaju kontakta, odmah isprati vodom i zatražiti savjet liječnika. Materijalna sigurnosna lista (MSDS sigurnosne specifikacije) dostupna je na zahtjev. DODATNI MATERIJALI I OPREMA PODRUČJE 1. Ekstrakcija RNA iz kliničkog materijala 1. seta reagensa za RNA / DNA „ribo- sorbira” (N) „ribo prep” (TU) ili drugih preporučeno FBUN CRI Epidemiology prilikom rada s potpunim oblicima 3, Laminarni boks. 3. Vortex. 4. epruvete za mikrocentrifugiranje za tipa „Eppendorf” tisuća do 12 g. 5. Termostat za cijevi, kao što su „Eppendorf” od 25 do 100 ° C 6. Automati za promjenjive volumena (od 5 do 50 ul, 20 ul u 200 i od 100 do 1000 l). 2 (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / str. 7, 32

7. Jednokratni polipropilenski vijčani ili čvrsto zatvoreni cijevi od 1,5 ml. 8. Jednokratni savjeti s filtrom do 100 μl, do 200 μl i do 1000 μl u tronošcima. 9. Vakuumni medicinski usisni uređaj s zamkom za hvatanje za uklanjanje supernatanta. 10. Savjeti za jednokratnu uporabu do 200 μl u stativu. 11. Stativi za cijevi volumena od 1,5 ml. 12. Hladnjak od 2 do 8 ° C 13. Odvojeni ogrtača, kape, cipele, jednokratnu rukavice MU kapaciteta s otopinom za dezinfekciju. PODRUČJE 2. Provedba reakcije reverzne transkripcije i pojačanje u „realnom vremenu” 1 Set reagensa za izvođenje reakcije reverzne transkripcije „Reverte-L» (W) za vrijeme rada tvori cjelokupnu 3, boks abacterial zraka okoline (PCR-box). 3. Centrifuga / vrtlog. 4. Automatski dozator volumena volumena (od 5 do 50 μl i od 20 do 200 μl). 5. Jednokratni savjeti s filtrom do 100 μl i do 200 μl u stativi. 6. Trio za 0,5 ml ili 0,2 ml ili 0,1 ml cijevi (prema vrsti cijevi koja se koristi). 7. Hladnjak od 2 do 8 ° C zamrzivač ne viša od 16 ° C 8 minus Odvojeni plaštem, kape, cipele, jednokratne rukavice MU sposobnosti za ponovno terminala. U obavljanju reakcije reverzne transkripcije pomoću „Reverte-L»: 10. jednokratnu polipropilenske epruvete od 0,2 ml ili 0,5 ml (ovisno o modelu koristi termocikleru ili termostata, naznačen time, da se provodi reakciju reverzna transkripcija). 11. Termostat za cijevi, kao što su "Eppendorf" od 25 do 100 ° C, ili programibilnog termičkog ciklusa (npr "Tertsik" ( "DNA Technology", Rusija), Gradient Palm Cycleru (Corbett Research, Australija), GeneAmp PCR sustavu 2700 (Applied Biosystems, USA). 12. postavljanje reakcije reverzne transkripcije na manje od 10 2 studija (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER /, str. 8 32

9 uzoraka automatski regulator volumena volumena (0,5 do 10 μl). 13. Pri određivanju reakcija reverzne transkripcije na manje od 10 uzoraka za ispitivanje za jednokratnu savjeta s filtrom 10 ul stativa. Kada se radi s "PCR kit": 14. programirati thermocycler Rotacijski tipa (na primjer, rotor-Gene 3000 ili 6000 (Corbett Research, Australija), rotor-Gene Q (Qiagen, Njemačka)), ili tableta-tipa termalnom cikličkom uređaju (npr icycler iq5 (Bio-Rad, SAD)) ili amplificirati SmartCycler II (Cepheid, SAD), ili Mx3000P, Mx3005P (Stratagene, USA) i preporučena FBUN institut za epidemiologiju u smjernicama za korištenje ovog seta reagensa). 15. jednokratnu polipropilenske epruvete za PCR: a) tankih stijenki PCR epruvete od 0,2 ml s konveksnom poklopac (nestripovannye ili stripovannye) korištenjem uređaja tableta tipa; b) tankih stijenki PCR epruvete od 0,2 ml s ravnim poklopcem (nestripovannye) ili stripovannye cijevi volumenu od 0,1 ml primjenom rotacijskog tipa uređaja. c) 0,025 ml PCR cijevi (Cepheid, USA) pomoću uređaja SmartCycler II (Cepheid, SAD). 16. Označeno tronožac (kada koristite instrumente tipa ploče). 17. jednokratnu polipropilensku cijevi za PCR (ravnog kapa, nestripovannye) 0,5 ml za centrifugiranje 18. i stoje za cijevi (Cepheid, USA) korištenjem SmartCycler II (Cepheid, SAD). Uzorak prikupljanje, transport i skladištenje ispitivanog materijala prije početka rada trebaju biti upoznati sa smjernicama „uzeti, prijevoz, skladištenje kliničkog materijala za PTsRdiagnostiki„razvio FSIS CRIE Rospotrebnadzor, Moskva, 2008. Za PCR studijama periferne plazme krvi. Za krvnoj plazmi prikupljeni u epruvetu s 3% otopine EDTA brzine od 20: 1 (20 dijelova krvi na 1 dio EDTA). Zatvorena ispitna epruveta s krvlju se okreće nekoliko puta. Unutar 6 sati od vremena prikupljanja krvi treba uzeti plazmu i prenijeti na novu cijev. Za ovu svrhu epruveta krvi se centrifugira 20 minuta pri g, nakon čega se prikupi i prebaci u plazmi za odvajanje za jednokratnu upotrebu (2x RG, IQ, Mx, dt, SC) / VER /, str. 9 32

10 epruveta. Plazma se može čuvati najviše 3 dana pri temperaturi od 2 do 8 ° C i dulje vrijeme na temperaturi koja nije veća od minus 68 ° C. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 10 od 32

11 FORMA FRT FORMA FRT SASTAV reagent kit „ribo-oskoruša” opcija 50 kit reagensa za ekstrakciju RNA / DNA iz kliničkog materijala, uključuje: Reagens Opis volumen, Max ml otopine za ližu Otopina za pranje jedno rješenje za pranje 3 Otopina za ispiranje 5 1 bočica boca 50 1 ampula 20 siječnja bočica sorbenta suspenzija bijele bris 1,25 1 0,5 RNA pufera cijevi 5 kit reagensa namijenjen za izolaciju RNA / DNA od 50 uzoraka, uključujući kontrole. Uključena u sklop kalupa 1 i 4. seta „ribo-prep” opcija 50 kit reagensa za ekstrakciju RNA / DNA iz kliničkog materijala, uključuje: Reagens Opis volumen, Max ml otopine za lizu da se istaloži otopine za ispiranje otopine za 3 pufer za pranje RNA-4 transparentno plave bočica boca 20 siječnja siječanj 25. 1 bočica boca 10 1.2 4 ampule kit reagensa namijenjen za izolaciju RNA / DNA od 50 uzoraka, uključujući kontrole. Uključena u sklop kalupa 2 i 5. reagensa kit „Reverte-L» 50 izvedbi seta kada su pohranjene na 3 otopine za ližu, otopine za ližu i za čišćenje 1, pri temperaturi od 2 do 8 ° C se može istaložiti kao kristali. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 11 od 32

12 FORMA FRT cDNA na predlošku RNA sadrži: RT-G-mix-1 reverzne transkriptaze (RT-mix MMlv) DNA Pufer reagens Opis Volume, 0,01 ml Max 0.125 5 cjevčice 5 0.03 cijevi 1 epruveti 1, 2 1 epruveta Reagensa 50 opcija je dizajnirana za 60 reverznih transkripcijskih reakcija, uključujući i kontrole. Kit reagensa "PCR" varijanta FRT-g1-4 kit reagensa za PCR amplifikaciju genotipova cDNA (1a, 1b, 2, 3a, 4) za otkrivanje HCV sa gibridizatsionnofluorestsentnoy u "realnom vremenu", uključuje: PCR smjesa-1 genotipovi FRT HCV genotipova 1b / 3a PCR mix-1 FRT HCV 1a / 2 PCR mix-1-FRT HCV EKR / genotip 4 reagens Opis volumen ml Broj RT-PCR smjese-2-FEP / FRT polimeraze (TaqF) FFP cDNA HCV genotipova 1b / 3a FFP cDNA genotipova HCV 1a / 2 FFP HCV cDNA EKR / 4 genotipa TE pufera cijevi 0,6 1 0,6 0,6 1 1 cijevi tube cijevi 3 0,3 0,03 3 cijevi 0,2 1 cijev 0,2 1 cijev 0,2 1 cijev 0,5 1 cijev K Komplet za reagens dizajniran je za 55 testova (165 reakcija amplifikacije), uključujući i kontrole. Uključena u sklop oblika 1, 2 i 3. set reagensa priloženih kontrolnih uzoraka ekstrakcija fazi :. 2 (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / stranica 12 32

13 Opis FORMA FRT Reagent volumen, ml Max OKO EKR STI-248-rec 0,5 0,5 1 1 cijev cijev Reagent Kit "PCR" varijanta FRT-g1-6 kit reagensa za PCR umnožavanje cDNA genotipova ( 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6), uz detekciju HCV gibridizatsionnofluorestsentnoy u "realnom vremenu", sadrži: Opis reagens volumen, ml Max PCR mix-1 genotipova HCV 1b FRT / 3a PCR smes- 1-FRT genotipova HCV 1a / 2 PCR mix-1 FRT HCV genotipova EKR / 4 PCR mix-1 genotipova HCV FRT 5a / 6 RT-PCR-smjesa 2-FEP / FRT polimeraze (TaqF) FFP cDNA HCV genotipovi 1b / 3a FFP cDNA HCV genotipova 1a / 2 FFP HCV cDNA EKR / 4 genotip FFP KDN genotipovi HCV 5a / 6 TE puferu tube 0,6 1 0,6 0,6 1 1 cijevi tube 1 cijev 0,6 0,3 0,03 4 4 cijevi epruvete 1 Epruveta 0,2 0,2 ​​0 1 cijevi, 2 1 epruveta 0.2 1 epruveta 0.5 1 epruveta Epruveta je dizajnirana za 55 testova (220 reakcija amplifikacije), uključujući i kontrole. Uključena u sklop formira 4., 5. i 6. seta reagensa priloženih faza kontrolne uzorke za ekstrakciju: 2 (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / stranica 13 od 32.

14 Opis FORMA FRT Reagent volumen, ml Max OKO EKR STI-248-rec 0,5 0,5 1 1 cijev cijev PCR RESEARCH RASPORED PCR studija sastoji se od slijedećih koraka: Ekstrakcija RNA iz kliničkih uzoraka. Izvođenje reverzne transkripcijske reakcije. Provodi pojačanje hibridizacijskim-fluorescentnim detekcijama u "real-time" načinu rada. Analiza i interpretacija rezultata. Potankosti ovog postupka analize se temelji na vrsti opreme koja se koristi je prikazana u „Smjernice za korištenje seta reagensa za određivanje i razlikovanje virusnih genotipova hepatitisa C (HCV) u kliničkim uzorcima lančanom reakcijom polimeraze (PCR), uz detekciju hibridizacije-fluorescentne” AmpliSens HCV genotip-FL »», razvijen od strane Središnjeg Research Institute of Epidemiology FBUN. OTKRIVANJE RNJU OD UZORAKA ZAHVATA POZOR! Prilikom rada s RNA samo trebate koristiti jednokratne plastične potrošnog materijala s posebnim obilježavanje «RNasefree», «DNaze bez». RNA ekstrakcija reagensa kompleti korištenim preporučuje FBUN CRI Epidemiology: koristeći postupak upravljanja „kit” ribo-sorbira reaktanti, vidi prilog 1 „ekstrakcije RNA pomoću reagensa kit” ribo-sorbira.”. koristeći kit reagensa "ribo-prep" postupka radi cm. u Dodatku 2 "ekstrakcije RNA pomoću reagensa kit" ribo-prep”. UPOZORENJE! Nastali pripravak RNA ne smije se skladištiti, obrnuto reakcije 2x (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / p. 14 32

15 FORMAT FRT transkripcija treba obaviti odmah nakon dobivanja RNA uzorka. PROVOĐENJE REAKCIJSKE REAKCIJE Ukupni volumen reakcijske smjese bio je 20 ul, uključujući volumen uzorka RNA od 10 ul. UPOZORENJE! Prilikom rada s RNA samo trebate koristiti jednokratne plastične potrošnog materijala s posebnim obilježavanje «RNasefree», «DNaze bez». A. Priprema cijevi za reverznu transkripciju Za umetanje reagensa i uzoraka RNA u cijevi koriste se jednokratni savjeti s filtrima. UPOZORENJE! Komponente reakcijske smjese trebaju se miješati neposredno prije reakcije reverzne transkripcije. 1. Prije nego što se rad počne odmrzavati, temeljito promiješajte na miješalici RT-mix i RT-G-mix-1. Ispustite kapljice iz poklopaca ispitne cijevi. 2. Uzmi potreban broj volumena cijevi od 0,2 ml i 0,5 (ovisno o modelu koristi termocikleru ili termostata) za provođenje reakcije reverzne transkripcije, sukladno broju kontrolnih uzoraka za testiranje i jedna kontrola (ekstrakcija (OK)). Označite epruvete. 3. Kod provođenja reverzne transkripcije uzoraka: a) Pripremite reakcijsku smjesu za 12 reakcija. Za ovu svrhu cijevi RT mješavine dodali 5 ul RT-G-mix-1, temeljito se pomiješaju vrtloženjem i talog kapi iz poklopca cijevi. b) Dodati 6 μl revertaze (MMlv) u dobivenu otopinu, pipete 5 puta, pomiješati s vrtlogom. Skratili su kapljice kapice cijevi kratkim centrifugiranjem. 4. Za izvođenje reverznu transkripciju manje od 10 uzoraka: Za pripremu reakcijske smjese moraju biti pomiješani u odvojenim reagensa tube temelju 1 reakcija je kako slijedi: 10 l RT-mix, 0,4 l RT-G-mix-1 i 0, 5 ul revertaze (MMlv) (vidi također Tablicu 1). Kod uvođenja smjese u RT-G-mix-1 i reverzne transkriptaze (MMlv) svakog reagensa pipete najmanje 5 puta. Temeljito promiješajte smjesu na vrtlog i precipitirajte kapljice kapice cijevi. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 15 od 32

16 FRT FORMAT UPOZORENJE! Povratak (MMlv) je toplinski osjetljiv! Nemojte ostavljati na sobnoj temperaturi dulje vrijeme! Odmah nakon uporabe, čistite hladnjak u zamrzivaču! Volumen reagensa na jedan reakcije (l) Broj kliničkih uzoraka Shema pripremiti reakcijsku smjesu 10,00 0,4 0,5 RT-mix RT-G-mix-1 reverzne transkriptaze (MMlv), 3. travnja, 8 3 2 4, 6 4,, 0 5.0. Dodati 10 ul pripremljene reakcijske smjese u pripremljene cijevi. Tablica 1 6. Dodati 10 μl RNA uzoraka izoliranih iz kliničkih i kontrolnih uzoraka na gotove epruvete u skladu s oznakom. Blago promiješajte na vrtloženju i istaložite kapljice kapice cijevi. UPOZORENJE! Prilikom dodavanja RNA uzoraka izoliranih s RIBO-Sorb reagens kitom, potrebno je izbjeći dobivanje sorbensa u reakcijsku smjesu. B. Provođenje reverzne transkripcijske reakcije 1. Stavite cijevi u termocikler (termostat) na 37 ° C tijekom 30 minuta. UPOZORENJE! Kada se koristi za određivanje reakcija reverzne transkripcije bicikliste sa sustavom za detekciju u „realnom vremenu” mora programirati uređaj za izvođenje programa (vidi, tablica. 2 i „Smjernice za korištenje reagensa kit za detekciju i razlikovanje virusnih genotipova hepatitisa C (HCV) u kliničkim uzorcima lančanom reakcijom polimeraze (PCR) s detekcijom fluorescencije hibridizacija-„AmpliSens HCV genotip-FL-» », namijenjen FBUN Epidemiology CRI). Tablica 2. 4. količine reaktanata uvedene su prikazani na temelju broja uzoraka (1 kliničkih uzoraka, a izolacija RNA kontrolnih faza) i zaliha pri 1 uzorku. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 16 od 32

17 FORMA FRT program za reverznu transkripciju na thermocyclers sa sustavom za detekciju u „realnom vremenu”, reakcijska 5 Korak temperature, C Vrijeme Fluorescencija Mjerenje Broj ciklusa od 1 min 2. Po završetku reakcijskoj posudi se doda 20 mikrolitara pufera DNA, koristeći novi Savjet s filterom za svaki uzorak. Lagano se promiješajte na vrtlog i istaložite kapljice kapice cijevi. Dobiveni u reverznoj transkripcijskoj reakciji kdnk koriste se za PCR amplifikaciju. Gotovi droga kdnk se može pohraniti na temperaturi koja nije veća od minus 16 ° C tijekom 1 tjedna ili na temperaturi koja nije veća od minus 68 ° C tijekom godine. Pojačanje sa detekcije u „stvarnom vremenu” A. Priprema epruveta za pojačavanje izbor cijevi za pojačanja ovisi o thermocvcler. Za umetanje reagensa, uzorci kdnk i kontrolni uzorci u cijevi koriste se jednokratni savjeti s filtrima. Ukupni volumen reakcijske smjese je 25 ul, uključujući volumen uzorka kdnk 10 ul. UPOZORENJE! Komponente reakcijske smjese trebaju se miješati neposredno prije izvođenja PCR testa. Miješanja reaktanata, ovisno o potrebnom broju reakcije, uključujući ispitivanje testnih i kontrolnih uzoraka, prema izračunatom potreban stol (vidi, tablica, 3, 4). A1. Priprema cijevi za pojačanje pomoću pribora "PCR" reagensi varijanta FRT-g1-4 primjer 5, rotor-Gene 3000 ili 6000 (Corbett Research, Australija); Rotor-Gene Q (Qiagen, Njemačka); iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P (Stratagene, SAD); "DT-96" ( "DNA Technology", Russia), te preporučuje FBUN CRI Epidemiology u smjernicama za korištenje ovog seta reagensa. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 17 od 32

18 FORMA FRT 1. Prije odmrzavanje, temeljito promiješati vrtlog sve reagense kit i talog kapi za kape cijevi. 2. Odaberite broj potrebnih testnih cijevi za amplifikaciju, uzimajući u obzir broj ispitnih i kontrolnih uzoraka (jedna kontrola ekstrakcije RNA, dvije kontrole pojačanja). Vrstu cijevi treba odabrati ovisno o upotrijebljenom instrumentu. UPOZORENJE! Svaki uzorak se analizira upotrebom tri reakcijske smjese, tako da za svaki uzorak treba pripremiti 3 epruvete. Kada pomoću naprave cijevi rotacijskim oznaku tipa „obraztsa_1b / 3a», «obraztsa_1a / 2" i "obraztsa_vko / 4", odnosno. Pri korištenju plošnih uređaja koristite označeni stativ za ove namjene. 3. Izaberite tri epruvete od 0,5 ml za pripremu reakcijskih smjesa. Označite epruvete za ispitivanje "1b / 3a", "1a / 2" i "VKO / 4". 4. U svakom od tri epruvetama namijenjenih za pripravu reakcijske smjese kako bi se brzina reakcije je 1: 5 l RT-PCR mix-2-FEP / FRT, 0,5 l polimeraze (TaqF) i 10 ul odgovarajućeg PCR mješavine -1 FRT HCV genotip (vidi, također stol. 3), PCR-mix-1 genotipova HCV 1b FRT / 3a se uvodi u cijev «1b / 3a» itd Rezultirajuća reakcijska smjesa miješa se i precipitira iz kapice cijevi. UPOZORENJE! Reakcijske smjese moraju se pripremiti s rezervom od 1 uzorka (vidi tablicu 3). 5. Dodati 15 ul pripremljene reakcijske smjese u epruvete za ispitivanje koje su namijenjene umnožavanju, u skladu s oznakom, tj. reakcijska smjesa "lb / 3a" uvedena je u cijevi označene kao "uzorak-lb / 3a" itd. 6. Pripremljeni cijevi sa izostaviti reakcijska smjesa je u skladu s obilježavanja Dodavanje 10 ul cDNA uzoraka dobivenih u reakciji reverzne transkripcije, svaki uzorak, uključujući negativne kontrole za ekstrakciju (C-), potrebno je u 3 bočice sadrži reakcijsku izostaviti smjese "1b / 3a", "1a / 2" i "VKO / 4". 7. stavi reakcije kontrolne: a) PCR negativna kontrola (K) dodati u epruvete koje sadrže reakcijske smjese Staviti «1b / 3a», «1a / 2" i "VRI / 4" u 10 ul TE pufera. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 18 od 32

19 FORMAT FRT b) pozitivne kontrole za PCR (K + 1b / 3a) u epruvetu koja sadrži reakcijsku smjesu «1b / 3a” dodati 10 ul cDNA FFP HCV genotipova 1b / 3a; c) PCR pozitivna kontrola (C + 1a / 2) u cijev koja sadrži reakcijsku smjesu «1a / 2" dodati 10 ul cDNA FFP HCV genotipova 1a / 2; d) PCR pozitivna kontrola (C + EKR / 4), cijevi sadrži reakcijske smjese „VRI / 4” dodati 10 ul FFP HCV cDNA EKR / genotipa 4. Shema pripremu reakcijske smjese za volumen varijanti FRT reagens po reakciji (l) Ne Ne klinička ispitivanja uzoraka točke 6 10,00 5,00 6 0,50 broj kliničkih uzoraka + 1 kontrola ekstrakcija RNA PCR fazi 2 + kontrola (N + 3, broj n od kliničkih uzoraka). PCR smjesa 1-FRT HCV genotipom * RT-PCR-2- smjesa FEP / FRT * Tablica 3 polimeraze (TaqF) +,,,,,,,,, 0 * Količine reagensa uvedenih s razlikom dao 1 uzorku. A2. Priprava epruvetama za pojačavanje pomoću PCR set „kit” reagensi varijantu FRT-g Prije odmrznuti, temeljito promiješati vrtlog sve reagense kit i talog kapi za kape cijevi. 2. Odaberite broj potrebnih testnih cijevi za amplifikaciju, uzimajući u obzir broj ispitnih i kontrolnih uzoraka (jedna kontrola ekstrakcije RNA, dvije kontrole pojačanja). Vrstu cijevi treba odabrati ovisno o upotrijebljenom instrumentu. UPOZORENJE! Svaki uzorak se analizira upotrebom četiri reakcijske smjese, pa se za svaki uzorak mora pripremiti 4 epruvete. Kada se koristi 0,2 ml epruvete za rotacijskom cijevi oznakom „obraztsa_1b / 3a» uređaja "obraztsa_1a / 2", "obraztsa_vko / 4" i "obraztsa_5a / 6", pojedinačno. Kada koristite uređaje s ravnim plohama ili kada koristite skrivenu 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 19 od 32

20 FORMAT FRT ispitne cijevi za instrumente tipa rotora koriste označeno stativ za ove namjene. 3. Izaberite četiri cijevi od 0,5 ml za pripremu reakcijske smjese. Označite cijevi "1b / 3a", "1a / 2", "VKO / 4" i "5a / 6". 4. U svakom od četiri cijevi namijenjene za pripremu reakcijske smjese kako bi se brzina reakcije je 1: 5 l RT-PCR-mix-2- FRT HCV genotipom (vidi Tablicu 4..), s PCR smjesi 1- Genotipi FRT HCV 1b / 3a su umetnuti u cijev "lb / 3a" itd. Rezultirajuća reakcijska smjesa miješa se i precipitira iz kapice cijevi. Shema za pripremanje reakcijske smjese varijantu FRT po reakcijskom volumenu reagens (l) Broj ispitnih uzoraka br klinički mjesta 7 10,00 5,00 0,50 FEP / FRT, 0,5 l polimeraze (TaqF) i 10 ul odgovarajućeg PCR mješavine -1-PCR-1 smjesa FRT HCV genotipom * RT-PCR-2- smjesa FEP / FRT * Tablica 4 polimeraze (TaqF) * * 0,,,,,,,,, iznose navedeni reaktanti uvedena uz stopu za 1 uzorak. 5. Dodati 15 ul pripremljene reakcijske smjese u epruvete za ispitivanje koje su namijenjene umnožavanju, u skladu s oznakom, tj. reakcijska smjesa "lb / 3a" uvedena je u cijevi označene kao "uzorak-lb / 3a" itd. Ako se za reakciju upotrijebi pojačanje cijevi za uklanjanje, reakcijske smjese treba uvesti u skladu sa shemom prikazanim na slici. 7 Broj kliničkih uzoraka + 1 kontrola faze ekstrakcije RNA + 2 PCR kontrole (N + 3, N broj kliničkih uzoraka). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 20 od 32

21 FORMAT FRT 4 cijevi se koriste za postavljanje klinički uzorak smjesa «1b / 3a» Smjesa «1a / 2" smjesa‘VRI / 4’smjesa‘5a / 6’Smjesa«1b / 3a»Smjesa« 1a / 2" smjesa " VKO / 4 »Smjesa« 5a / 6 »Slika 1. Shema za uvođenje reakcijskih smjesa i uzoraka pri korištenju cijevi za poliranje za proizvodnju PCR-a. 6. Pripremljeni cijevi sa izostaviti reakcijska smjesa u skladu s oznakama Dodavanje 10 ul cDNA uzoraka dobivenih u reakciji reverzne transkripcije, svaki uzorak, uključujući ekstrakciju negativne kontrole (C-), da se u epruvete koje sadrže 4 reakcijske izostaviti smjese "1b / 3a", "1a / 2", "EKO / 4" i "5a / 6". 7. stavi kontrolne reakcije: a) PCR negativna kontrola (K) dodaje u epruvete koje sadrže reakcijske smjese Staviti «1b / 3a», «1a / 2", "VRI / 4" i "5a / 6" u 10 ul TE puferu, b) pozitivna kontrola za PCR (K + 1b / 3a) u epruvetu koja sadrži reakcijsku smjesu «1b / 3a” dodati 10 ul cDNA FFP HCV genotipova 1b / 3a; c) PCR pozitivna kontrola (C + 1a / 2) u cijev koja sadrži reakcijsku smjesu «1a / 2" dodati 10 ul cDNA FFP HCV genotipova 1a / 2; d) PCR pozitivna kontrola (C + EKR / 4), cijevi sadrži reakcijske smjese "VRI / 4" dodati 10 ul FFP HCV cDNA EKR / 4 genotip; d) PCR pozitivna kontrola (C + 5a / 6), u cijevi s reakcijska smjesa «5a / 6" dodati 10 ul cDNA FFP HCV genotipova 5a / 6. B. Provedba otkrivanje pojačanje u „realnom vremenu” uređaj 1. program (biciklista sa sustavom detekcije u „realnom vremenu”) za obavljanje odgovarajuće pojačanje i detekcija fluorescentnog signala programa „AmpliSens-1” (vidi, tablica. 5, 6 ). Tablica 5 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 21 od 32

22 FORMA FRT «AmpliSens-1„program rotacijske uređaje 8 temperature Trajanje Mjerenje broj Stupanj C fazi ciklusa fluorescencija učvršćivanje / min 1 držati temp-ra 95 5/5 Biciklizam kruženje 95 5 biciklizam 2 / FAM / zelenog sa 40 biciklizam 2 JOE / žuta iz tablice 6 „AmpliSens-1” za tablete tipa uređaja 9 i naprave Smart Cycler II (Cepheid, USA) Korak temperature Trajanje mjerenja broj od koraka ciklusa fluorescencije min (900 do 10) sa s 95 5 s s FAM, JOE / HEX / Cy sa 2. Instalirajte ispitne epruvete u ćelijama reakcijskog modula instrumenta. 3. Pokrenite izvođenje programa pojačala detekcijom fluorescentnog signala. 4. Nakon završetka programa, počnite analizirati i tumačiti rezultate. ANALIZA I TUMAČENJE REZULTATA Analiza rezultata provodi se pomoću softvera uređaja koji se koristi za provođenje PCR-a s otkrivanjem u stvarnom vremenu. Krivulje su analizirane nakupljanje fluorescentnog signala u kanalu za fluorofornoj FAM (ili slično), a kanal za fluorofora JOE (ili sličnim). Rezultati su interpretirani na temelju prisutnosti (ili odsutnost) primjera 8, Rotor-Gene 3000 ili 6000 (Corbett Research, Australija), Rotor-Gene P (Qiagen, Njemačka). Na primjer, icycler iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P, Mx3005 (Stratagene, SAD); "DT-96" ( "DNA Technology", Russia), te preporučuje FBUN CRI Epidemiology u smjernicama za korištenje ovog seta reagensa. 10 za Smart Cycler II (Cepheid, SAD). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 22 od 32

23 FORMA fluorescencija krivulja FRT raskrižje instaliran na odgovarajućoj razini granične linije, koji detektira prisustvo ili odsustvo () uzorka cDNA vrijednosti praga ciklusa Ct u odgovarajućem stupcu u tablici rezultata. Rezultat amplifikacije kanala se smatra pozitivnim ako je fluorescencija krivulja ima tipičnu realnom vremenu PCR S-obliku oblika, nakon presijeca praga linija u značajan porast fluorescencije, negativan u odsutnosti krivulje tipičnog oblika i presjeka s praga linije (bez vrijednosti Ct ili Cp) i upitno u svim ostalim slučajevima. Tablica 7 prikazuje kanale kroz koje se genotipovi HCV detektiraju za svaku reakcijsku smjesu. Tablica 7. Reakcijska smjesa «1b / 3a«»1a / 2" "VRI / 4" "5a / 11 Lipanj" Channel Prepoznatljiva genotipova HCV FAM / zelena 1b 1a ASD 5a Joe / HEX / žuta / Cy3 3a računovodstvene rezultate i u kontrolnim uzorcima rezultata PCR analiza se smatra pouzdanim, ako dobiveni rezultati prolazi testni uzorci u skladu s reakcijama kontrolu rezultata evaluacije tablica (vidi. tablicu. 8). 11 Uključeno u verziju PCR kompleta FRT-g1-6. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 23 od 32

24 FORMA FRT kontrola reaktivna Nye smjesa redu K K + 1 b / 3a Rezultati za kontrola različitim stupnjevima analize FAM / zelena br vrijednosti Ct br vrijednosti Ct ispod granična vrijednost TABLICA 8 «1b / 3a«»1a / 2" „VRI / 4 »« 5a / 6 '12 rezultati pojačanje kanala JOE / hex / žuta / Cy3 FAM / zelena JOE / HEX / žuta / Cy3 FAM / zelena JOE / HEX / žuta / Cy3 FAM / zelena JOE / HEX / Yellow / Cy3 Ne značaj vrijednost Ct br ct ispod granične vrijednosti K + 1a / 2 * * Ne Ne ct vrijednosti Ct vrijednost Ne Ne ct vrijednost vrijednost ct ispod granične vrijednosti nema Ct vrijednosti otsuts tvuet vrijednosti Ct br Ct vrijednosti ne vrijednosti Ct Ne vrijednosti Ct Ne vrijednosti Ct broj vrijednosti Ct * * * * * * ispod granične vrijednosti ispod graničnih vrijednosti K + EKR / 4 * * * * * * * * ispod granične vrijednosti ispod graničnih vrijednosti K + 5a / 6 * * * * * * * Ova reakcijska smjesa nije ispitana. * * Ispod granične vrijednosti OPREZ! Granične vrijednosti Ct su naznačene u umetku u PCR kit. Interpretacija rezultata u istraživanju kliničkih uzoraka ispod granične vrijednosti 1. HCV genotipom prisutan u uzorku utvrđeno je usporedbom pojačanje u tri rezultata (za „PCR kit” varijanta FRT-g1-4) ili četiri cijevi (za „PCR kit” varijanta FRT-g1-6) u skladu sa Tablicom. 7, a) Ako je vrijednost Ct koja odgovara jednom genotipu HCV RNA određena u tablici rezultata za uzorak, rezultat je "Genotip"; b) Ako se u tablici rezultata za uzorak utvrdi dvije ili više Ct vrijednosti, tada se genotip daje za dvostruko, trostruko, itd. Iznimka je sljedeći predmet Ako uzorak određene vrijednosti Ct u reakcijsku smjesu „VRI / 4” kanal JOE / HEX / žuta / Cy3 (4 HCV genotip) i «1b / 3a» reakcijska smjesa kanal FAM / zeleno (1b genotipom HCV), naznačen time, da Ct vrijednost 4. genotipa veći Ct vrijednosti za prvu genotipa na 10 ili više ciklusa, izdan 12 je dio PCR kit varijanti FRT-g1-6. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 24 od 32

25 FORMAT FRT rezultat "Genotip 4". U tablici 2. Ako su rezultati za Ct vrijednosti uzorka određuje samo za VRI (reakcijske smjese „VRI / 4», FAM / zelena kanal), te je ispod granične vrijednosti postavljen u košuljici, rezultat daje «HCV genotip nije određena.” Ako je poznato da je koncentracija HCV RNA u ovom uzorku unutar analitičke osjetljivosti kompleta reagensa, dolazi do rezultata "HCV genotip nije utvrđen zbog niske količine virusa". 3. Ako je tablica rezultata za uzorke bez Ct vrijednosti za sve genotipove i Ct vrijednosti za EKR (FAM kanala u PCR-mix-1-FRT HCV EKR / genotipom 4) nije definiran prelazi granicu (navedeno u umetku), a zatim potrebno je ponoviti PCR studiju ovog uzorka, počevši od koraka ekstrakcije RNA. UPOZORENJE! 1. Ako se vrijednost Ct najmanje u jednom uzorku s PCR koraka pozitivna kontrola (K + 1b / 3a, K + 1a / 2, K + EKR / 4 ili K + 5a / 6) prelazi graničnu vrijednost navedenu u košuljici ili odsutan, potrebno je ponovite PCR test za sve uzorke, počevši od koraka ekstrakcije. 2. Ako negativna kontrola za RNA ekstrakciju (OK) na barem jedan od reakcijskih smjesa «1b / 3a», «1a / 2», «5a / 6" s bilo kojim od korištenih kanala i / ili„VRI / 4, u reakcijsku smjesu „kanal otkrivenih pozitivno JOE / HEX / žuto / Cy3 signala, ponoviti PCR za sve uzorke studija za koje je reakcijska smjesa genotip HCV-a određuje iz koraka ekstrakcije RNA. 3. Ako negativna kontrola PCR (K) za svaku reakcijsku smjesu u skladu s bilo kojim od kanala detektira pozitivni signal, ponoviti PCR za sve uzorke studija za koje je reakcijska smjesa Genotip HCV-a određuje iz koraka ekstrakcije RNA. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 25 od 32

26 Životni prostor, uvjeti prijevoza i skladištenja Rok trajanja. 12 mjeseci Skup reagenata s isteklom rokom valjanosti ne podliježe primjeni. Datum isteka otvorenih reagensa odgovara datumu isteka navedenog na naljepnicama za neotvorene reagense, osim ako nije drugačije navedeno u uputi. Prijevoz. Komplet za reagens treba transportirati na temperaturi od 2 do 8 ° C ne dulje od 5 dana. Nakon primanja, rastavite u skladu s navedenim temperaturama za pohranu. Skladištenje. Kompleti reagensa "ribo-sorbira" i "ribo-prep" pohranjena na 2 do 8 ° C kompletima reagensa „Reverte-L» i «PCR„, osim kit OKO, TE pufera i EKR STI-248-rec skladištenja na temperaturi ne višoj od 16 C. minus OKO, tE pufera i EKR STI-248 za bilježenje od "PCR kit" pohranjena na 2 do 8 ° C za PCR smjesa je bila-1 genotipova HCV 1b FRT / 3a PCR mix-1 genotipova HCV FRT 1a / 2, PCR-mix-1 FRT HCV EKR / 4 genotipa HCV genotipova i PCR-smjesa-1 FRT 5a / 6 pohranjeni na tamnom mjestu. Uvjeti za dopust. Za liječenje i preventivne i sanitarne prostore. Pritužbe na kvalitetu skupa „AmpliSens HCV-genotip-FL» reagense usmjerene na proizvođača FBUN središnji istraživački institut epidemiologije (ul. Novogireevskaya, d. 3a) Divizije radu sa zahtjevima i organizacije za osposobljavanje (tel. (495) faks (495), povratne informacije i prijedloge o proizvodu "AmpliSens" možete ostaviti, ispunjavanjem obrasca na web stranici potrošača: 2 (RG, iQ, MX, DT, SC) / VER / stranica 26 od 32.

27. Dodatak 1. Ekstrakcija RNA ekstrakcije RNA korištenjem „ribo-sorbira” Postupak 1. Kit reagensa za liziranje i otopina za pranje otopinom 1 (ako su pohranjeni na 2 do 8 ° C), toplo na 60 ° C do kompletnog otapanja kristala. 2. Odaberite potrebni broj jednokratnih ispitnih epruveta za 1,5 ml (uključujući negativnu kontrolu ekstrakcije). Označite epruvete. 3. Na dnu svake cijevi, dodajte 10 μl EKO STI-248-rec. 4. Dodajte 450 μL otopine lize na ispitne epruvete. Označite epruvete. Napomena uz veliki volumen uzorka kako bi se olakšao postupak izolacije može miješati u odvojenoj tikvici lizu otopine i EKR STI-248 za bilježenje (bazirano na jednom uzorku 450 ul otopine za ližu i 10 l EKR STI-248-rec) i zatim razmak od 450 ul u prethodno pripremljene cijevi od 1,5 ml. 5. Dodajte 100 μl uzorka u epruvete s otopinom lize i VKO, koristeći savjete s filterom. U negativnoj kontroli (OK) cijevi za ekstrakciju, dodajte 100 ul OKO. 6. nepropustno uzorak potpuno vrtloženjem i protsentrifugirovat miješano 5 sekundi na 5 tisuća okretaja / min u mikrocentrifugi ukloniti kapi iz unutarnje površine poklopca cijevi. 7. Resuspendirajte sorbent, snažno miješajući na vrtlog. Dodajte 25 μl resuspendiranog sorbenta u svaku epruvetu sa zasebnim vrhom. 8. Miješajte sadržaj vortex cijevi i ostavite ih 10 minuta na sobnoj temperaturi, temeljito miješajući svake 2 minute. 9. centrifugiranje su epruvete za mikrocentrifugiranje na 7. g (npr 10 tisuća okretaja / min MiniSpin centrifugi Eppendorf) tijekom 1 min. 10. Izvadite iz svake cijevi supernatant sa zasebnim vrhom, koristeći vakuumsku jedinicu. 11. Dodajte 400 ul otopine za ispiranje na epruvete za testiranje. 1. Miješajte na vrtloženju dok se sorbent potpuno ne resuspendira. Centrifugirajte cijevi u mikrocentrifugi na 7.000 g tijekom 1 minute. Izaberite supernatant 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 27 od 32

28 RNA ekstrakcija iz svake cijevi sa zasebnim vrhom, pomoću vakuumske usisne jedinice. 12. Dodati 500 ul otopine za ispiranje na epruvete. 3. Pomiješati vrtlog do potpunog resuspenzija sorbenta. Centrifugirajte cijevi u mikrocentrifugi na 7.000 g tijekom 1 minute. Odaberite rješenje za pranje 3 iz svake cijevi s posebnim vrhom, koristeći vakuumsku jedinicu. 13. Dodajte 400 ul otopine za ispiranje na epruvete 4. Miješajte na vrtloženju dok se sorbent potpuno ne resuspendira. Centrifugirajte cijevi u mikrocentrifugi na 7.000 g tijekom 1 minute. Potpuno uklonite otopinu za pranje 4 iz svake cijevi sa zasebnim vrhom, koristeći vakuumsku jedinicu. 14. Osušiti sorbent stavljanjem cijevi s otvorenim poklopcima u termostat na temperaturi od 60 ° C 15 minuta. 15. Resuspendiraju sorbent u 50 ul RNA pufera. Zagrijavanje peći na temperaturi od 60 ° C tijekom 2 min, pomiješan vrtloženjem i centrifugirati da se istaloži sorbent na 12 tisuća g (npr okr / min na centrifugi Eppendorf MiniSpin) tijekom 1 min. UPOZORENJE! Dobivena RNA pripravka nije podložna skladištenju, reverzna transkripcijska reakcija treba provesti neposredno nakon dobivanja uzorka RNA. Uzmite RNA otopinu za reakciju vrlo pažljivo, bez hvatanja sorbenta. Ako je sorbent uznemiren, potrebno ga je istaložiti na centrifugi. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 28 od 32

29 DODATAK 2 Izdvajanje RNA ekstrakcije RNA pomoću postupka „kit ribo-prep” reagensa 1. Otopina za liziranje (ako je pohranjena na 2 do 8 ° C), toplo na 65 ° C do kompletnog otapanja kristala. 2. Odaberite potrebni broj jednokratnih ispitnih epruveta za 1,5 ml (uključujući negativne i pozitivne kontrole ekstrakcije). 3. Na dnu svake cijevi, dodajte 10 μl EKO STI-248-rec. 4. Dodajte 300 ul otopine lize u epruvete za ispitivanje. Označite epruvete. Napomena uz veliki volumen uzorka kako bi se olakšao postupak izolacije može miješati u odvojenoj bočici lize i EKR STI-248 za bilježenje (bazirano na jednom uzorku 300 ul lizu i 10 ul EKR STI-248-rec) i nakon toga razmak 300 ml smjese u prethodno pripremljene cijevi od 1,5 ml. 5. U cijevi s otopinom za lizu i VKO, dodajte 100 μl uzorka pomoću savjeta s filterom. U negativnoj kontroli (OK) cijevi za ekstrakciju, dodajte 100 ul OKO. 6. Epruvete se dobro izmiješaju vrtloženjem protsentrifugirovat 5 sekundi u mikrocentrifugi ukloniti kapi iz unutarnje površine poklopca, a da se zagrije 5 minuta na 65 ° C u inkubatoru. 7. Dodati 400 μL otopine za taloženje u epruvete, temeljito promiješati s vrtlogom. 8. centrifugiranje su epruvete za mikrocentrifugiranje na 12 tisuća g (npr okr / min na centrifugi Eppendorf MiniSpin) tijekom 5 min. 9. Pažljivo uklonite supernatant bez dodirivanja sedimenta pomoću vakuumskog aspirata i zasebnog vrha za svaki uzorak. 10. Dodajte 500 μl otopine za ispiranje na epruvetama 3, čvrsto zatvorite pokrivače, nježno operite sediment, okrećući epruvete 3-5 puta. Moguće je provesti postupak u isto vrijeme za sve cijevi, potrebno je pokriti epruvetu u stalak na vrhu poklopca ili drugog stalka, pritisnite ih i okrenuti stativ. 11. Centrifugirajte na 12.000 g tijekom 1 do 2 minute u mikrocentrifugi. 12. Pažljivo, bez izdvajanja taloga, supernatant se, 2x (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / p. 29 32

30 RNA ekstrakcijom pomoću vakuumske usisne jedinice i zasebnog vrha za svaki uzorak. 13. Dodajte 200 jal otopine za ispiranje 4 u epruvetu, zatvorite poklopce čvrsto i nježno operite kuglicu okretanjem cijevi 3-5 puta. Istodobno možete provesti postupak za sve cijevi, jer za to morate pokriti cijevi na tronošcu s gornje strane poklopca ili drugog stativa, pritisnuti ih i okretati tronožac. 14. Centrifugirajte na 12.000 g tijekom 2 minute u mikrocentrifugi. 15. Pažljivo, bez hvatanja sedimenta, pažljivo odabrati supernatant pomoću vakuum usisne jedinice i zasebni savjet za svaki uzorak. 16. Stavite cijevi u termostat na temperaturi od 65 ° C tijekom 5 minuta kako bi se suhi mulj (s poklopcima cijevi otvorili). Dodati 50 ul RNA pufera na cijevi. Umiješajte na vrtlog. Stavite u termostat na 65 ° C 5 minuta, povremeno ga trese na vrtlog. Centrifugirajte cijevi na 12.000 g tijekom 1 minute u mikrocentrifugi. Supernatant sadrži pročišćenu RNA. Uzorci su spremni za reakciju reverzne transkripcije i PCR. UPOZORENJE! Dobivena RNA pripravka nije podložna skladištenju, reverzna transkripcijska reakcija treba provesti neposredno nakon dobivanja uzorka RNA. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 30 od 32

31 SIMBOLI KORIŠTENI U TISKANIM PROIZVODIMA Dio broj šaržnog koda Oprez! Pogledajte popratnom maksimalnog dokumentacija broj testnog proizvoda je za in vitro dijagnostičku uporabu u toku promjene granica Temperatura gornje granice, pogledajte upute za uporabu Izbjegavajte suncu datum proizvodnje Proizvođač 2 (RG, iQ, MX, DT, SC) / VER / p 31 od 32

32. izdanje LA IVl mjesto mijenja Podnožje podnoĹľju list bit promjena izmjene doda kataloški broj R-V1-G (1-4) - 2 (RG, iQ, Mx, dt, SC), kako bi se dobilo komplet 3 Uklanjanje kataloške brojeve za formulacije 1 i 4 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / stranica 32 od 32

Amplisense hcv fl

Faze hepatitisa c
Mpiviropack cijena

Sve o hepatitisu C

Liječenje, simptomi, lijekovi

Hepatitis s rcc amplicon hcv fl

Hepatitis s rcc amplicon hcv fl

Hepatitis se naziva akutnim i kroničnim upalnim bolestima jetre, koje nisu žarišne, ali česte. U različitim hepatitisima metode infekcije su različite, također se razlikuju u stupnju progresije bolesti, kliničkim manifestacijama, metodama i prognozi terapije. Čak i simptomatologija različitih tipova hepatitisa je različita. I neki simptomi su teži od drugih, što je određeno tipom hepatitisa.

Glavni simptomi

  1. Žutilo. Često se javlja simptom i posljedica je činjenice da bilirubin ulazi u krv pacijenta s oštećenjem jetre. Krv, koja cirkulira kroz tijelo, nosi ga u organe i tkiva, bojajući ih žutom bojom.
  2. Pojava boli u području pravog hipohondrija. Pojavljuje se zbog povećanja veličine jetre, što dovodi do pojave boli, koji su tup i produljeni ili su paroksizmom.
  3. Pogoršanje zdravlja, popraćeno groznicom, glavobolja, vrtoglavica, probavni poremećaji, pospanost i letargija. Sve ovo je posljedica djelovanja bilirubina na tijelu.

Hepatitis je akutan i kroničan

Hepatitis kod pacijenata ima akutne i kronične forme. U akutnom obliku, oni se manifestiraju u slučaju oštećenja virusnih jetri, kao i ako je bilo trovanja različitim vrstama otrova. U akutnim oblicima bolesti, stanje pacijenata brzo se pogoršava, što pridonosi ubrzanom razvoju simptoma.

S ovim oblikom bolesti moguća su predviđanja. S izuzetkom njegove transformacije u kronični. U akutnom obliku, bolest se lako dijagnosticira i lakše liječi. Neobrađen akutni hepatitis lako se razvija u kronični oblik. Ponekad se kod teških trovanja (npr. Alkohola) kronični oblik pojavljuje sam. U kroničnom obliku hepatitisa odvija se proces zamjene vezivnog tkiva jetrenih stanica. To je slabo izraženo, sporo je i stoga ponekad i dalje nedijagnosticirano sve do pojave ciroze jetre. Kronični hepatitis tretira se još gore, a prognoza njezina lijeka je manje povoljna. U akutnom tijeku bolesti znatno pogoršava zdravlje, žutica se razvija, čini se opijenost, rad funkcija smanjuje bilirubin jetre povećava u krvi. S pravodobnim otkrivanjem i učinkovitim liječenjem hepatitisa u akutnom obliku, bolesnik se najčešće oporavlja. S trajanjem bolesti više od šest mjeseci, hepatitis prolazi u kronični oblik. Kronični oblik ove bolesti dovodi do ozbiljnih poremećaja u tijelu - povećanje slezene i metabolizam jetre je poremećena, nastaju komplikacije kao što su ciroza jetre i stvaranja raka. Ako pacijent ima slab imunitet, terapijska shema je netočna ili postoji ovisnost o alkoholu, prijelaz hepatitisa u kronični oblik ugrožava život pacijenta.

Vrste hepatitisa

Hepatitis ima nekoliko tipova: A, B, C, D, E, F, G, oni se nazivaju i virusni hepatitis, jer je uzrok njihove pojave virus.

Ova vrsta hepatitisa naziva se Botkinova bolest. Ima period inkubacije od 7 dana do 2 mjeseca. Njegov uzročnik - RNA virus - može se prenijeti od bolesne osobe do zdrave osobe kroz loše proizvode i vodu, kontakt s predmetima kućanstva koje je pacijent koristio. Hepatitis A moguć je u tri oblika, podijeljeni prema snazi ​​manifestacije bolesti:

  • u akutnom obliku s žuticom, jetra je ozbiljno oštećena,
  • kada subakutni bez žutice, možemo govoriti o lakšoj inačici bolesti,
  • u subkliničnom obliku, ne možete ni primijetiti simptome, iako je zaražena izvor virusa i sposobna je zaraziti druge.

Ova bolest se također naziva serumski hepatitis. Uz to je porast jetre i slezene, pojava boli u zglobovima, povraćanje, temperatura, oštećenje jetre. Ona teče bilo u akutnim ili kroničnim oblicima, što određuje stanje imuniteta bolesne osobe. Načini infekcije: tijekom injekcija s kršenjem sanitarnih pravila, spolnog odnosa, tijekom transfuzije krvi, uporabom slabo dezinficiranih medicinskih instrumenata. Trajanje razdoblja inkubacije iznosi 50 ÷ 180 dana. Incidencija hepatitisa B opada s cijepljenjem.

Ova vrsta bolesti je jedna od najozbiljnijih bolesti, jer je često praćena cirozom ili rakom jetre, što dovodi do kobnog ishoda. Bolest nije podložna terapiji, a štoviše, nakon što se ponovo pojavila s hepatitisom C, osoba može opetovano biti zaražena istom bolešću. Nije lako izliječiti HCV: nakon akutnog hepatitisa C, 20% ljudi se oporavlja, au 70% pacijenata tijelo se ne može sama izliječiti od virusa i bolest postaje kronična. Utvrditi razlog zašto su neki sami izliječeni, a drugi nisu, ali to nije bilo moguće. Kronični oblik samog hepatitisa C neće nestati pa ga treba liječiti. Dijagnoza i liječenje akutnih oblika HCV provodi liječnik infektivne bolesti, kronični oblik bolesti - hepatolog ili gastroenterolog. Moguće je zaraziti tijekom transfuzije plazme ili krvi od zaraženog davatelja, pri upotrebi slabo obrađenog medinstrumentova, seksualno, a bolesna majka prenosi infekciju djetetu. Virus hepatitisa C (HCV) se brzo širi diljem svijeta, broj pacijenata je dugo premašio stotinu i stotinu milijuna ljudi. Prije toga HCV nije podnio terapiju, ali sada se bolest može izliječiti korištenjem suvremenih protuvirusnih lijekova s ​​izravnim djelovanjem. Samo ova terapija je prilično skupo, ali zato to svatko ne može priuštiti.

Ova vrsta hepatitisa D moguće je samo kada je koinficirana virusom hepatitisa B (ko-infekcija - slučaj infekcije jedne stanice virusa različitih tipova). Uz to je masovno oštećenje jetre i akutni tijek bolesti. Načini infekcije - dobivanje virusa bolesti u krv zdrave osobe od nosača virusa ili bolesne osobe. Razdoblje inkubacije traje 20 ÷ 50 dana. Izvana, tijek bolesti boluje od hepatitisa B, ali njegov oblik je teži. Može postati kronično, nakon što ode u cirozu. Moguće je provesti cjepivo slično onoj koja se koristi za hepatitis B.

To malo podsjeća na hepatitis A po stazi i mehanizmu prijenosa, budući da se također prenosi putem krvi. Njegova je osobitost pojava munje-brzih oblika, što uzrokuje smrtni ishod ne više od 10 dana. U drugim se slučajevima može učinkovito izliječiti, a prognoza za oporavak često je povoljna. Izuzetak može biti trudnoća, jer je rizik od gubitka djeteta blizu 100%.

Ova vrsta hepatitisa još nije proučavana. Poznato je samo da je bolest uzrokovana dva različita virusa: jedan je izoliran iz krvi darivatelja, drugi je pronađen u izmetu pacijenta koji je primio hepatitis nakon transfuzije krvi. Simptoma: vrućica, žutica, ascites (nakupljanje tekućine u abdomenu), povećana jetra i slezena, porast razine bilirubina i jetrenih enzima, pojava promjena u urinu i fecesu, kao i opće intoksikacije. Učinkovite metode terapije hepatitisom F još nisu razvijene.

Ova vrsta hepatitisa slična je hepatitisu C, ali ne tako opasnom, jer ne pridonosi nastanku ciroze i raka jetre. Cirroza se može pojaviti samo u slučaju ko-infekcije hepatitisa G i C.

dijagnostika

Virusni hepatitis sličan je međusobnim simptomima, baš kao i neke druge virusne infekcije. Zbog toga je teško točno odrediti dijagnozu pacijenta. Prema tome, kako bi se pojasnio tip hepatitisa i ispravna svrha terapije, potrebni su laboratorijski krvni testovi kako bi se identificirali markeri-pokazatelji koji su specifični za svaku vrstu virusa. Nakon identificiranja prisutnosti takvih markera i njihovog omjera, moguće je odrediti stupanj bolesti, njegovu aktivnost i mogući ishod. Da bi se pratila dinamika procesa, nakon vremenskog razdoblja, anketa se ponavlja.

Kako se liječi hepatitis C?

Sadašnji režimi tretmana kronične HCV smanjene kombiniranom terapijom, uključujući antivirusniki antivirusnu direktnog djelovanje sofosbuvir, velpatasvira, daklatasvira, ledipasvira u raznim kombinacijama. Ponekad se ribavirin i interferoni dodaju kako bi se poboljšala njihova učinkovitost. Ova kombinacija aktivnih tvari zaustavlja replikaciju virusa, štedi jetru od destruktivnih učinaka. Takva terapija ima nekoliko nedostataka:

  1. Troškovi lijekova za borbu protiv virusa hepatitisa su visoki, a svi ih ne mogu kupiti.
  2. Uzimanje određenih lijekova popraćeno je neugodnim nuspojavama, uključujući groznicu, mučninu, proljev.

Trajanje liječenja kroničnih oblika hepatitisa traje od nekoliko mjeseci do godinu dana, ovisno o genotipu virusa, stupnju oštećenja tijela i korištenim lijekovima. Budući da hepatitis C prvenstveno utječe na jetru, pacijenti moraju slijediti strogu prehranu.

Značajke genotipova HCV-a

Hepatitis C je jedan od najopasnijih virusnih hepatitisa. Bolest je uzrokovana virusom koji sadrži RNA, nazvanu Flaviviridae. Virus hepatitisa C također se zove "blagi ubojica". Takav nepogrešiv epitet kojeg je dobio zbog činjenice da u početnoj fazi bolest nije popraćena nikakvim simptomima. Nema znakova klasične žutice, nema boli na području pravog hipohondrija. Utvrdite prisutnost virusa ne može ranije od nekoliko mjeseci nakon infekcije. A prije toga, nema potpuno reakcije imunološkog sustava i nemoguće je otkriti markere u krvi, pa stoga nema mogućnosti genotipizacije. Posebnost HCV-a je također da se nakon ulaska u krvotok tijekom procesa reprodukcije, virus počinje brzo mutirati. Takve mutacije ometaju imunološki sustav zaraženih prilagoditi i boriti se protiv bolesti. Kao rezultat toga, bolest može trajati nekoliko godina bez ikakvih simptoma, nakon čega se pojavljuje gotovo ciroza ili maligni tumor. I u 85% slučajeva bolest iz akutnog oblika postaje kronična. Virus hepatitisa C ima važnu značajku - raznolikost genetske strukture. Zapravo, hepatitis C je zbirka virusa klasificiranih prema varijanti njihove strukture i podijeljen u genotipove i podtipove. Genotip je zbir gena koji kodiraju nasljedne osobine. Dok medicina zna 11 genotipova virusa hepatitisa C, koji imaju svoje podtipove. Genotip je označen brojevima od 1 do 11 (iako se u kliničkim ispitivanjima uglavnom koristi genotip 1 ÷ 6), a podtipovi, koristeći slova latinske abecede:

U različitim zemljama genotipovi HCV-a se distribuiraju na različite načine, na primjer, u Rusiji se najčešće nalazi od prvog do trećeg. Ozbiljnost tijeka bolesti ovisi o vrsti genotipa, određuju shemu terapije, njezinu trajnost i rezultat liječenja.

Dok se svijet širi HCV sojevima

Genotipovi hepatitisa C distribuiraju se heterogeno diljem svijeta, a najčešće se nalaze genotipovi 1, 2 i 3, a na nekim područjima izgleda ovako:

  • u Zapadnoj Europi iu istočnim regijama genotipovi 1 i 2 najčešći su,
  • u SAD-u, podtipovi la i lb,
  • u sjevernoj Africi najčešći je genotip 4.

U zonama rizika moguće HCV infekcije su osobe s krvnim bolestima (tumori hematopoetskih sustava, hemofilija itd.), Kao i pacijenti koji leže na liječenju u odjelima za dijalizu. Najčešći je na svijetu genotip 1 - za koji se računa

50% od ukupnog broja slučajeva. Na drugom mjestu u prevalenciji - genotipu 3 s nešto više od 30%. Širenje HCV-a diljem Rusije ima značajne razlike od svjetskih ili europskih opcija:

  • račun za genotip 1b

50% slučajeva,

  • na genotipu 3a

    20%

  • hepatitis 1a su zaraženi

    10% pacijenata,

  • pronađen je hepatitis s genotipom 2

    Ali ne samo da genotip ovisi o težini HCV terapije. Na učinkovitost liječenja također utječu sljedeći čimbenici:

    • starost bolesnika. Mogućnost liječenja mladih ljudi je znatno veća,
    • žene se mogu izliječiti lakše nego muškarci,
    • važan stupanj oštećenja jetre - prednost ishoda je veća s manje oštećenja,
    • veličina virusnog opterećenja - manje virusa u tijelu u vrijeme liječenja, to je učinkovitija terapija,
    • težina bolesnika: što je veći, to je složenija terapija.

    Stoga se liječenje odabire od strane liječnika koji se bazira na gore navedenim čimbenicima, genotipiziranju i preporukama EASL-a (European Association for Liver Disease). EASL preporučuje da njegove preporuke budu ažurirane i, kako se pojavljuju novi učinkoviti lijekovi, liječe preporučene hepatitis C režime.

    Tko je u opasnosti za HCV infekciju?

    Kao što je poznato, virus hepatitisa C prenosi se kroz krv, pa je najvjerojatnije da se zaraze:

    • pacijenata koji primaju transfuziju krvi,
    • pacijenata i klijenata u stomatološkim ordinacijama i medicinskim ustanovama, gdje nepravilno steriliziraju medicinske instrumente,
    • zbog ne sterilnih alata, može biti opasno posjetiti manikure i salone za uljepšavanje,
    • od slabo oblikovanih alata također mogu patiti ljubitelji piercinga i tetovaža,
    • rizik infekcije je visok među onima koji koriste lijekove zbog ponovljene uporabe ne sterilnih igala,
    • fetus može postati inficiran od majke zaražene hepatitisom C,
    • na seksualnom certifikatu ili djelovati infekcija također može doći do organizma zdrave osobe.

    Što se liječi hepatitisom C?

    Virus hepatitisa C nije uzalud bio smatran "ublaženom" virusom ubojice. To se godinama ne može manifestirati, nakon čega se iznenada pojavljuje u obliku komplikacija uz cirozu ili rak jetre. No, dijagnoza HCV je stavila više od 177 milijuna ljudi u svijetu. Liječenje, koje je korišteno do 2013, kombinirane injekcije interferona i ribavirina, omogućilo je pacijentima mogućnost ozdravljenja, ne prelazeći 40-50%. Štoviše, bilo je popraćeno ozbiljnim i bolnim nuspojavama. Situacija se promijenila u ljeto 2013. godine, nakon što je farmgigantom američki Gilead Sciences patentirali sofosbuvir tvar ispušta u obliku lijeka pod markom Sovaldi, koji se sastoji od 400 mg lijeka. Postao je prvi antivirusni lijek s izravnim djelovanjem (PDPD) u borbi protiv HCV-a. Rezultati kliničkih ispitivanja sofosbuvir drago medicinske učinkovitosti, koja se postiže u skladu s genotipom vrijednosti 85 ÷ 95%, a trajanje terapije u usporedbi s obradom s interferona i ribavirina, više nego dvostruko. I dok drugmaker sofosbuvir patentirao Gilead, sintetiziran je 2007. godine Michael Sofiji, zaposlenik tvrtke Pharmasett, stekao naknadno Gilead Sciences. Od imena Michaela, tvar koju je sintetizirala naziva se sofosbuvir. Sam Michael Sofija zajedno sa skupinom znanstvenika koji su napravili niz otkrića koja otkrivaju prirodu HCV, čime se stvara učinkovit lijek za to liječenje, osvojio je Lasker-DeBakey kliničkih medicinskih istraživanja za. Dobit od implementacije novog učinkovitog alata gotovo je sve otišla u Gilead, koja je postavila monopolne cijene na Sovvaldi. Štoviše, tvrtka je branila svoj razvoj posebnim patentima, prema kojima Gilead i neke od njegovih partnerskih tvrtki postaju vlasnici ekskluzivnog prava na proizvodnju originalnog PFDP-a. Kao rezultat toga, Gilead stigao u samo prve dvije godine provedbe lijeka u više navrata blokirao sve troškove koje je tvrtka nastale u stjecanju Pharmasett, dobivanje patenta i kasnije kliničkih ispitivanja.

    Što je Sofosbuvir?

    Učinkovitost ovog lijeka u borbi protiv HCV-a bila je tako visoka da sada gotovo nikakva terapijska shema nije potpuna bez njezine primjene. Sophosbuvir se ne preporuča za monoterapiju, ali u složenoj upotrebi pokazuje izuzetno visoke rezultate. U početku je lijek korišten u kombinaciji s ribavirinom i interferonom koji je u nekompliciranim slučajevima dozvolio da se traži lijek u samo 29 tjedana. I to unatoč činjenici da je samo terapija interferonom i ribavirinom bila polovica djelotvorna, a njezino trajanje ponekad premašilo 40 tjedana. Nakon 2013, svaka sljedeća godina donijela vijest o pojavi sve više i više novih lijekova koji uspješno bore protiv virusa hepatitisa C:

    • u 2014. pojavio se daklatasvir,
    • 2015. bila je godina rođenja ladypasvira,
    • 2016. je zadovoljan stvaranjem velpatasvira.

    Daklataswir je objavio Bristol-Myers Squibb kao pripravak Daklinza koji sadrži 60 mg aktivnog sastojka. Dvije sljedeće tvari stvorile su snage znanstvenika Gileada, a budući da nitko od njih nije bio prikladan za monoterapiju, u kombinaciji sa sofosbuvirom koristili su se samo lijekovi. Da bi se olakšala primjena terapije Gileadom, novo stvoreni lijek odmah je pušten, u kombinaciji sa sophosbuvirom. Dakle, bilo je i priprema:

    • Harvoni, kombinirajući sophosbuvir 400 mg i ladypasvir 90 mg,
    • Epclusa, koja je uključivala sofosbuvir 400 mg i velpatasvir 100 mg.

    Uz terapiju pomoću daklatasvira, trebalo je uzeti dva različita pripravka Sowaldi i Daklinsu. Svaka od uparenih kombinacija aktivnih tvari korištena je za liječenje određenih genotipova HCV-a prema terapijskim režimima koje preporučuje EASL. A samo kombinacija sophosbuvire s velpathasvirom pokazala se pangenotipskim (univerzalnim) lijekom. Eclusus je izliječio sve genotipove hepatitisa C s praktično jednakom visokom učinkovitošću od približno 97 ÷ 100%.

    Pojava generičkih lijekova

    Klinička ispitivanja potvrdila su učinkovitost liječenja, ali svi ti visoko učinkoviti lijekovi imali su jedan značajan nedostatak - previsoke cijene, koje im ne dopuštaju kupiti većinu bolesnika. Monopolistički visoke cijene za proizvode utvrđene Gilead, izazvao zgražanje i skandal koji je napravio Prijavitelji napraviti određene ustupke, ostavljajući neke tvrtke iz Indije, Pakistana, Egipta i dozvola za proizvodnju analoge (generičkih) je toliko učinkovita i popularna droga. Štoviše, borba s nositeljima patenata, koja nudi lijekove za liječenje pristranih cijena, na čelu s Indijom, kao zemlja u kojoj žive milijuni pacijenata s kroničnim hepatitisom C. Kao rezultat ove borbe - Gilead izdala 11 dozvola za indijske tvrtke i razvoj patenta za samostalno puštanje sofosbuvir, a zatim svoje druge nove lijekove. Nakon što je dobio dozvolu, indijski proizvođači brzo su uspostavili proizvodnju generičkih lijekova, pri čemu su proizvodi proizvedeni vlastiti trgovački nazivi. Tako se prvi put pojavio Soveneri jenerkiki, zatim Daklinza, Harvoni, Epclusa, a Indija je postala svjetski lider u svojoj produkciji. Indijski proizvođači pod licenčnim ugovorom plaćaju 7% zaradenih sredstava u korist vlasnika patenata. Ali čak i kod ovih plaćanja troškovi generičkih lijekova proizvedeni u Indiji bili su desetaka puta manji od izvornika.

    Mehanizmi djelovanja

    Kao što je već napomenuto gore, nove pojave HCV terapije su povezane s PFDD i izravno utječu na virus. Dok je interferon s ribavirinom, ranije korišten za liječenje, ojačao ljudski imunološki sustav, pomažući tijelu da se odupre bolesti. Svaka od tvari djeluje na virus na svoj način:

    1. Sofosbuvir blokira RNA polimerazu, čime se inhibira replikaciju virusa.
    1. Daklatasvir, lepidavir i velpathaswir su NS5A inhibitori koji sprječavaju širenje virusa i njihov ulazak u zdrave stanice.

    Takav usmjereni učinak uspješno se može boriti s HCV-om, primjenjujući se za terapiju sophosbuvirom u kombinaciji s daklatasvirom, ledipasvirom, velpatasvirom. Ponekad, kako bi se pojačao učinak na virus, treću komponentu dodaje se paru, što je najčešće ribavirin.

    Proizvođači generičkih lijekova iz Indije

    Tvrtke u zemlji koristile su dozvole koje su im dodijeljene, a sada Indija proizvodi sljedeće generacije: Sovaldi:

    • Hepcvir je proizvođač Cipla doo,
    • Hepcinat - Natco Pharma Ltd.,
    • Cimivir - Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • MyHep je proizvođač Mylan Pharmaceuticals Private Ltd.,
    • SoviHep - Zydus Heptiza doo,
    • Sofovir je proizvođač Hetero Drugs Ltd.,
    • Resof - proizvodi tvrtku Dr. Reddy # 8217, s Laboratories,
    • Virso - pušta Strides Arcolab.

    Analoge s Daklinsa također čine u Indiji:

    • Natdac iz Natco Pharma,
    • Dacihep iz Zydusa Heptize,
    • Daclahep iz Hetero Drugs,
    • Dactovin iz Strides Arcolab,
    • Daclawin iz Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • Mydacla od Mylan Pharmaceuticals.

    Nakon Gileada, indijski proizvođači lijekova također su svladali proizvodnju Harvonija, što je rezultiralo takvim genericima:

    • Ledifos - objavljuje Hetero,
    • Hepcinat LP - Natco,
    • Myhep LVIR - Mylan,
    • Hepcvir L - Cipla doo,
    • Cimivir L-Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • LediHep - Zydus.

    I već je 2017. godine započela produkcija sljedećih indijskih generičkih lijekova:

    • Velpanat je objavio farmaceutsku tvrtku Natco Pharma,
    • puštanje Velasof je ovladao Hetero Drugs,
    • SoviHep V je pokrenuo Zydus Heptiza.

    Kao što vidite, indijske farmaceutske tvrtke ne zaostaju za američkim proizvođačima, brzo svladavajući novo razvijene lijekove, promatrajući sve kvalitativne, kvantitativne i terapijske karakteristike. Osim toga, uključujući farmakokinetičku bioekvivalentnost u odnosu na izvornike.

    Zahtjevi za generičke lijekove

    Općenito se naziva lijek koji može zamijeniti osnovne lijekove s patentom za bitna farmakološka svojstva. One se mogu osloboditi i u prisutnosti i nedostatku licence, samo njegova dostupnost čini proizveden analogni licenciran. U slučaju da je licenca odobrena indijskim farmaceutskim tvrtkama, Gilead ih je osigurao tehnologijom proizvodnje, dajući vlasnicima licenci pravo na neovisnu politiku cijena. Da bi se analozi lijeka smatrali generičkim, moraju odgovarati brojnim parametrima:

    1. Potrebno je promatrati omjer najvažnijih farmaceutskih sastavnica u pripremi prema kvalitativnim i kvantitativnim standardima.
    1. Pridržavajte se relevantnih međunarodnih standarda.
    1. Obvezno je poštivanje odgovarajućih uvjeta proizvodnje.
    1. Ekvivalent ekvivalenta parametara usisavanja trebao bi se održavati u pripravcima.

    Valja napomenuti da je WHO posvećen zaštiti dostupnosti lijekova, koji uz pomoć generičkih proračuna zamjenjuje s njima skupe lijekove s markom.

    Egipatska generacija sophosbuvira

    Za razliku od Indije, egipatske farmaceutske tvrtke nisu izbile u vodeće svjetske proizvođače genetike iz hepatitisa C, iako su uspjeli proizvoditi analoge sofosbuvira. Istina, u većini analoga koje proizvode njih nisu licencirani:

    • MPI Viropack, proizvodi lijek Marcyrl Pharmaceutical Industries # 8229, jedan od najranijih egipatskih generacija,
    • Heterosofir, koji je objavio Pharmed Healthcare. to je jedini licencirani generik u Egiptu. Na paketu pod hologramom skriven je kod koji omogućuje provjeru originalnosti proizvoda na web stranici proizvođača, čime se isključuje njegova krivotvorenja,
    • Grateziano, proizvođač Pharco Pharmaceuticals,
    • Sofolanork, produciran od strane Vimeo,
    • Sofocivir, kojeg proizvodi ZetaPhar.

    Generici za kontrolu hepatitisa iz Bangladeša

    Još jedna zemlja koja proizvodi generičke lijekove u velikim količinama protiv HCV je Bangladeš. Štoviše, ova zemlja čak nema potrebe za dozvolama za proizvodnju analoga lijekova s ​​markom, budući da do 2030. godine farmaceutske tvrtke mogu proizvesti takve lijekove bez dostupnosti odgovarajućih dokumenata za licenciranje. Najpoznatiji i opremljen najnovijom tehnologijom je farmaceutska tvrtka Beacon Pharmaceuticals Ltd. Projekt proizvodnih kapaciteta stvorili su europski stručnjaci i ispunili svjetske standarde. Beacon proizvodi slijedeće generičke lijekove za liječenje hepatitisa C:

    • Soforal, generički sophosbuvira, sadrži aktivnu tvar od 400 mg. Za razliku od tradicionalnih pakiranja u bocama od 28 komada, Sophoral proizvodi u obliku blistera od 8 tableta u jednoj ploči,
    • Daclavir je daklatasvira generička, jedna tableta lijeka sadrži 60 mg aktivnog sastojka. Također ga oslobađaju u obliku blistera, ali svaka ploča sadrži 10 tableta,
    • Sofosvel je generička epclusa koja sadrži sofosbuvir 400 mg i velpatasvir 100 mg. Pangenotipski (univerzalni) lijek djelotvoran je u terapiji genotipova HCV 1 ÷ 6. U ovom slučaju ne postoji uobičajeno pakiranje u bočicama, pilule su pakirane u blistere od 6 komada u svakoj ploči.
    • Darvoni je kompleksan pripravak koji kombinira somosbuvir 400 mg i daklatasvir 60 mg. Ako je potrebno, kombinirajte terapiju s sofosbuvirom s daklatasvirom, koristeći preparate drugih proizvođača, potrebno je uzeti tablete svake vrste. Beacon ih je stavio u jednu pilulu. Darvoni je pakiran u blistere od 6 tableta u jednoj ploči, poslan samo za izvoz.

    Kada kupujete lijekove tvrtke Beacon temeljem tijeka terapije, treba uzeti u obzir originalnost svoje ambalaže kako bi se kupila količina potrebna za liječenje. Najpoznatije indijske farmaceutske tvrtke Kao što je gore spomenuto, nakon što su farmaceutske tvrtke u zemlji dobile dozvole za proizvodnju generičkih lijekova za HCV terapiju, Indija je postala svjetski lider u njihovoj proizvodnji. No, među mnogim tvrtkama valja istaknuti nekoliko, čiji su proizvodi u Rusiji najpoznatiji.

    Natco Pharma doo

    Najpopularnija farmaceutska tvrtka Natco Pharma doo, lijekovi koji spasiti živote nekoliko desetaka tisuća slučajeva kroničnog oblika hepatitisa C. savladao proizvodnju gotovo cijele linije antivirusnih lijekova izravna akcija, uključujući sofosbuvir s daklatasvirom i ledipasvir s velpatasvirom. Natco Pharma pojavio se 1981. godine u gradu Hyderabadu s početnim kapitalom od 3,3 milijuna rupija, a zatim je zaposlenih 20 ljudi. Sada u Indiji pet tvrtki Natko zapošljava 3.500 ljudi, a u drugim zemljama postoje i podružnice. Pored proizvodnih odjela, tvrtka ima dobro opremljene laboratorije koji omogućuju razvoj suvremenih lijekova. Među vlastitim razvojem, vrijedno je spomenuti i droge za borbu protiv raka. Jedan od najpoznatijih lijekova na ovom području je Veenat, proizveden od 2003. godine i korišten u leukemiji. Da, a oslobađanje generičkih lijekova za liječenje hepatitisa C prioritetno je područje za Natco.

    Hetero droga doo

    Ova tvrtka ima za cilj proizvoditi generičke proizvode, podvrgavajući tu želju vlastitoj mreži industrije, uključujući tvornice s poslovnicama i uredima s laboratorijima. Proizvodna je mreža Hetero zatvorena za proizvodnju lijekova na temelju licenci koje je dobila tvrtka. Jedno od smjerova njegove aktivnosti su lijekovi koji dopuštaju borbu s ozbiljnim virusnim bolestima, čije liječenje za mnoge pacijente postalo je nemoguće zbog visokih troškova originalnih lijekova. Stečena licenca dopušta Heteru da brzo započne izdavanje generičkih lijekova koji se prodaju po povoljnim cijenama za pacijente. Stvaranje Hetero droga datira iz 1993. godine. Tijekom proteklih 24 godine na teritoriju Indije pojavile su se desetak tvornica i desetaka proizvodnih jedinica. Prisutnost vlastitih laboratorija omogućuje tvrtki da provede eksperimentalni rad na sintezi tvari, što je doprinijelo širenju baze proizvodnje i aktivnom izvozu lijekova u inozemstvo.

    Zydus Heptiza

    Zydus je indijska tvrtka koja je postavila kao cilj formiranje zdravih društava, koje će, prema svojim vlasnicima, pratiti promjena u boljem kvalitetu življenja ljudi. Cilj je plemenit, a stoga ga postiže tvrtka provodi aktivne obrazovne aktivnosti koje utječu na najsiromašnije dijelove stanovništva zemlje. Uključujući besplatno cijepljenje stanovništva protiv hepatitisa B. Zidus u smislu proizvodnje na indijskom farmaceutskom tržištu nalazi se na četvrtom mjestu. Osim toga, 16 njegovih proizvoda uključeno je u popis od 300 osnovnih lijekova indijske farmaceutske industrije. Zydus proizvodi su traženi ne samo na domaćem tržištu, već se mogu naći u ljekarnama 43 zemlje našeg planeta. A asortiman lijekova proizvedenih u 7 poduzeća prelazi 850 priprema. Jedan od njegovih najmoćnijih proizvodnih pogona nalazi se u državi Gujarat i pripada najvećem ne samo u Indiji, već iu Aziji.

    HCV terapija 2017

    Režimi liječenja hepatitisa C za svakog pacijenta odabiru liječnik pojedinačno. Za točan, učinkovit i siguran odabir režima, liječnik treba znati:

    • genotip virusa,
    • trajanje bolesti,
    • stupanj oštećenja jetre,
    • prisustvo / odsutnost ciroze, istodobna infekcija (npr. HIV ili drugi hepatitis), negativno iskustvo prethodnog liječenja.

    Nakon što je primio ove podatke nakon provedbe ciklusa analiza, liječnik na temelju preporuka EASL odabire najbolju varijantu terapije. EASL preporuke ispravljaju se iz godine u godinu, a dodaju se i novi lijekovi. Prije preporuke novih terapija, oni se podnose Kongresu ili posebnom sastanku na razmatranje. Godine 2017. EASL posebna sjednica razmotrila je ažuriranje preporučenih programa u Parizu. Odlučeno je potpuno zaustaviti primjenu interferonske terapije u liječenju HCV u Europi. Osim toga, nije bilo preporučene sheme korištene s jednim lijekom izravne akcije. Evo nekoliko preporučenih opcija za režim liječenja. Svi se daju samo za referencu i ne mogu postati vodič za djelovanje, jer imenovanje terapije može dati samo liječnik, pod nadzorom kojeg će kasnije proći.

    1. Mogući režimi liječenja koje je predložio EASL u slučaju oneinfekcije hepatitisa C ili popratne HIV + HCV infekcije u bolesnika koji nemaju cirozu i koji nisu prethodno liječeni:
    • za liječenje genotipovi la i lb možete koristiti:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, bez ribavirin, trajan 29 tjedana, # 8229, sophosbuvir + daklatasvir, također bez ribavirina, razdoblje liječenja je 29 tjedana, # 8229, ili sofosbuvir + velpatasvir bez ribavirina, trajanje tečaja je 29 tjedana.

    • s terapijom genotip 2 primjenjuju se bez ribavirina 29 tjedana:

    # 8229, sofosbuvir + dklatasvir, # 8229, ili sophosbuvir + velpathaswir.

    • u liječenju genotip 3 bez upotrebe ribavirina za razdoblje od 29 tjedana liječenja:

    # 8229, sophosbuvir + daklutasvir, # 8229, ili sofosbuvir + velpatasvir.

    • s terapijom genotip 4 moguće je primijeniti bez ribavirina 29 tjedana:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, # 8229, sophosbuvir + daklutasvir, # 8229, ili sofosbuvir + velpatasvir.

    1. Preporučeni režimi EASL terapije za monoinfekciju hepatitisa C ili popratnu HIV / HCV infekciju u bolesnika s kompenziranom cirozom koji nisu prethodno liječeni:
    • za liječenje genotipovi la i lb možete koristiti:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir s ribavirinom, trajanje 29 tjedana, # 8229 ili 24 tjedna bez ribavirina, # 8229, i još jedna mogućnost - 24 tjedna s ribavirinom s nepovoljnom prognozom odgovora, # 8229, sophosbuvir + daklutasvir, ako bez ribavirina, zatim 24 tjedna, i ribavirinom, razdoblje liječenja od 29 tjedana, # 8229, ili sofosbuvir + velpatasvir bez ribavirin, 29 tjedana.

    # 8229, sofosbuvir + dklatasvir bez ribavirin za 29 tjedana, i ribavirinom zbog nepovoljne prognoze od 24 tjedna, # 8229, ili sophosbuvir + velpathaswir bez kombinacije s ribavirinom tijekom 29 tjedana.

    # 8229, sophosbuvir + daklatasvir tijekom 24 tjedna uz ribavirin, # 8229, ili sofosbuvir + velpatasvir ponovno s ribavirinom, razdoblje liječenja je 29 tjedana, # 8229, kao varijanta je moguće snove + vidilac 24 tjedna, ali već bez zamjene.

    • s terapijom genotip 4 primjenjuju iste sheme kao u genotipima La i lb.

    Kao što vidite, rezultat terapije utječe kombinacija propisanih lijekova, osim stanja pacijenta i karakteristika njegovog tijela. Osim toga, trajanje liječenja ovisi o kombinaciji koju odabere liječnik.

    Liječenje s modernim lijekovima iz HCV-a

    Uzmite tablete pripravaka izravnog antivirusnog djelovanja kako ih je propisano liječnikom usmeno jednom dnevno. Nisu podijeljeni na dijelove, nisu žvakani, one se ispiru ravnom vodom. To je najbolje učiniti istovremeno, tako da održavate konstantnu koncentraciju u tijelu aktivnih tvari. Vezivanje na vrijeme unosa hrane nije potrebno, glavna stvar - nemojte to učiniti na prazan želudac. Nakon što počnete uzimati lijekove, obratite pozornost na stanje zdravlja jer je tijekom tog perioda najlakše primijetiti moguće nuspojave. Oni nemaju puno PDPD-a, ali lijekovi propisani u kompleksu su mnogo manji. Najčešće se nuspojave očituju kao:

    • glavobolje
    • povraćanje i vrtoglavicu,
    • opća slabost,
    • pogoršanje apetita,
    • bol u zglobovima,
    • promjene u biokemijskim razinama krvi, izražene u niskoj razini hemoglobina, smanjenje trombocita i limfocita.

    Nuspojave su moguće u malom broju bolesnika. Ali svejedno, sve zabilježene bolesti treba obavijestiti liječnika koji je pohađao da poduzima potrebne mjere. Kako se ne bi povećali nuspojave, alkohol i nikotin trebaju biti isključeni, jer negativno utječu na jetru.

    kontraindikacije

    U nekim slučajevima, prihvaćanje PDPD je isključeno, ona se odnosi na:

    • individualna preosjetljivost pacijenata na neke sastojke lijekova,
    • pacijenti mlađi od 18 godina, jer ne postoje precizni podaci o njihovim učincima na tijelo,
    • žene koje nose fetus i dojilje,
    • žene bi trebale koristiti pouzdane metode kontracepcije kako bi se izbjeglo začeće tijekom razdoblja terapije. I ovaj uvjet odnosi se na žene čiji su partneri također podvrgnuti PADA terapiji.

    Spremite antivirusne lijekove izravne akcije na mjestima nedostupnima djeci i učincima direktne sunčeve svjetlosti. Temperatura skladištenja mora biti u rasponu od 15 ÷ 30 ° C. Prilikom uzimanja lijekova provjerite njihova vremena proizvodnje i skladištenja na pakiranju. Nedozvani lijekovi zabranjeni su. Kako kupiti PPPD ruskim građanima Nažalost, ne možete pronaći indijske generičke lijekove u ruskim ljekarnama. Farmaceutska tvrtka Gilead, nakon što je dobila dozvolu za proizvodnju priprema, razborito zabranila izvoz u mnoge zemlje. Uključujući sve europske zemlje. Oni koji žele kupiti buduće indijske generičke lijekove za borbu protiv hepatitisa C mogu iskoristiti prednosti na nekoliko načina:

    • naručite ih putem ruskih mrežnih ljekarni i dobivate robu za nekoliko sati (ili dana) ovisno o mjestu isporuke. I u većini slučajeva, ni avansno plaćanje neće biti potrebno,
    • naručite ih putem indijskih mrežnih trgovina kod kuće. To će zahtijevati plaćanje unaprijed u valuti, a vrijeme čekanja trajat će od tri tjedna do mjesec dana. Osim toga, dodati ćete potrebu komuniciranja s prodavateljem na engleskom,
    • otići u Indiju i donijeti drogu. To će također zahtijevati vrijeme, uz jezičnu barijeru, kao i složenost provjere originalnosti robe kupljene u ljekarni. Dodat će se i svim problemima neovisnog izvoza, koji zahtijevaju termo kontejner, dostupnost zaključka liječnika i recept na engleskom jeziku te kopija čeka.

    Oni koji su zainteresirani za kupnju lijekova odlučuju za sebe koja od mogućih opcija dostave odabrati. Samo ne zaboravite da u slučaju HCV, povoljan rezultat terapije ovisi o brzini njezina nastanka. Ovdje u doslovnom smislu, kašnjenje u smrti je slično, pa stoga ne vrijedi odgađati početak postupka.